聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一種基礎的實驗室技術，用於擴增 DNA 序列，使研究人員能更容易分析特定基因或關注的片段。隨著時間發展，PCR 衍生出多種變化版本，以滿足不同的研究與診斷需求。以下將簡單介紹 PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR 與 dPCR，幫助您在不同應用中選擇合適的方法。

什麼是 PCR（聚合酶鏈式反應）？

PCR（又稱為終點 PCR、傳統 PCR 或常規 PCR）是一種廣泛使用的實驗室技術，能將特定 DNA 序列大量擴增，從極少量的起始樣本中產生數百萬份拷貝。這個過程包含三個主要步驟：

1. 變性（Denaturation）：將反應混合物加熱至約 94–98°C，使雙股 DNA 分開成為兩條單股。
   
2. 退火（Annealing）：將溫度降至約 50–65°C，使短片段的 DNA 引子（primer）能與單股 DNA 模板上的互補序列結合。
   
3. 延伸（Extension）：將溫度升至約 72°C，這是 DNA 聚合酶的最佳作用溫度，可在引子上延伸並添加核苷酸，合成新的 DNA 鏈。
   

這三個步驟會在一種稱為 熱循環儀（thermal cycler） 的設備中重複 20–40 個循環，最終使目標 DNA 序列呈指數倍數增殖。

PCR 技術由 Kary Mullis 於 1983 年發明，徹底革新了分子生物學，使科學家能夠在不需要大量起始樣本的情況下，研究特定的 DNA 區段。

PCR 的基本組成包括：

• 熱循環儀（thermal cycler）：精準控制溫度變化
  
• DNA 引子（primers）
  
• 核苷酸（nucleotides）
  
• DNA 聚合酶（最常用為 Taq polymerase）
  
• 待擴增的 DNA 模板（template）
  

這項方法是眾多領域的基礎工具，包括遺傳學研究、法醫科學與臨床診斷，使得基因複製、病原體檢測與基因突變分析等任務變得更加可行。

熱啟動 PCR（Hot Start PCR）

熱啟動 PCR 是傳統 PCR 的改良版本，旨在提升特異性與產量。

在傳統 PCR 中，DNA 聚合酶在反應準備階段即可能於較低溫下被活化，導致非特異性擴增以及引子二聚體（primer dimers）的形成。熱啟動 PCR 透過在初始變性步驟之前保持 DNA 聚合酶處於不活化狀態，來解決這個問題。常見方法是利用化學修飾酶或抗體，在室溫下暫時抑制聚合酶的活性。

當反應混合物在變性階段加熱後，這些修飾便會被移除，聚合酶隨之被活化。這種受控的活化方式能避免不必要的擴增，最終產生更乾淨且更精確的 PCR 結果。

什麼是 qPCR（定量 PCR）/ 即時 PCR（Real-time PCR）？

定量 PCR，通常稱為 qPCR 或即時 PCR，是一種能同時 擴增並定量 DNA 序列 的實驗室技術。

不同於傳統 PCR 僅能在反應結束時顯示 DNA 的有無，qPCR 可在 擴增過程中測量 DNA 濃度。其原理是使用螢光染劑或探針，當其與雙股 DNA 結合時會發出螢光。隨著 DNA 的擴增，螢光強度會成比例增加，進而實現即時監測。

這種方法讓科學家能在每個循環中測量 DNA 的數量，提供 質性與量化數據。qPCR 具備極高靈敏度與特異性，因此廣泛應用於 基因表現分析、病原體檢測與基因變異研究。由於能快速且精確地定量 DNA，qPCR 已成為分子生物學與醫學診斷中不可或缺的技術。

什麼是 RT-PCR（反轉錄 PCR）？

RT-PCR（Reverse Transcription PCR，反轉錄聚合酶鏈式反應）是一種能讓科學家研究 RNA 的技術，方法是 將 RNA 轉換為 DNA。

這個過程由一種名為 反轉錄酶（reverse transcriptase） 的酵素開始，將 RNA 轉換為互補 DNA（cDNA）。接著，cDNA 經由 PCR 擴增，便能進行更深入的分析。

RT-PCR 對於 檢測 RNA 病毒 及 研究基因表現 特別有價值。由於能擴增特定 RNA 序列，它在研究與診斷中都是強大的工具。透過揭示基因活性與 RNA 型生物（如病毒）的存在，RT-PCR 已成為分子生物學中的核心方法之一。

什麼是 RT-qPCR（反轉錄定量 PCR）？

RT-qPCR（Reverse Transcription Quantitative PCR，反轉錄定量聚合酶鏈式反應）是一種強大技術，結合了 RNA 的反轉錄與定量 PCR。需注意，這裡的「RT」代表 Reverse Transcription（反轉錄），而不是 Real-Time（即時）。

此方法能同時 檢測與定量 RNA 標的物，因此在 基因表現分析與 RNA 病毒檢測 中不可或缺。流程為：首先使用反轉錄酶將 RNA 轉換為 cDNA，接著以 cDNA 作為模板進行定量 PCR，透過螢光偵測在即時反應中擴增並測量目標序列的數量。

RT-qPCR 具有高度靈敏性與特異性，能偵測低含量 RNA 分子。其定量特性可精準測量基因表現水平，為細胞功能與疾病機制提供重要洞察。同時，它也是 RNA 病毒檢測的標準方法，例如 新冠病毒（SARS-CoV-2），因此在疾病診斷與管理中發揮了巨大作用。

什麼是 dPCR（數位 PCR）？

數位 PCR（Digital PCR, dPCR）是一種先進的 DNA 與 RNA 偵測與定量方法。

一個 dPCR 的工作流程可分為四個階段：準備（Preparation）、分隔（Partitioning）、擴增（Amplification）、分析（Analysis）。

1. 準備（Preparation）
   首先，從樣本中提取 DNA 或 RNA，並進行純化，再與反應成分混合，這些成分包括引子（primers）、核苷酸（nucleotides）、DNA 聚合酶以及螢光探針或染劑。
   
2. 分隔（Partitioning）
   接著，將混合物分隔成數千個微小、獨立的反應區域，常用的技術包括微流體晶片或液滴產生器。每個分隔中可能含有零個、一個或少數幾個目標 DNA 分子。這種獨特的方法能以極高的精準度鎖定並計算目標分子。
   
3. 擴增（Amplification）
   在擴增階段，每個分隔會進行熱循環（與傳統 PCR 相似），以擴增其中的目標 DNA。若目標 DNA 被擴增成功，該分隔會產生螢光訊號。
   
4. 分析（Analysis）
   最後，統計所有「陽性分隔」（產生螢光的分隔）數量，並利用統計學方法計算出原始樣本中 DNA 或 RNA 的絕對數量。
   

dPCR 的最大特色之一是能夠提供 絕對定量（Absolute Quantification）。換句話說，它能直接測量 DNA 或 RNA 分子的確切數量，而不需要依賴像 qPCR 那樣的標準曲線比較。

這使 dPCR 特別適合用於需要極高精準度的情境。同時，它對樣本中可能干擾結果的雜質不敏感，即使在複雜樣本（如血液或環境樣本）中，依然能保持高度可靠與一致性。

不過，dPCR 也有其限制：需要專門的設備來產生這些微小分隔並進行偵測，操作相對複雜。但在追求 高靈敏度、精確性與可靠性 的應用上，dPCR 幾乎無可取代。

PCR vs qPCR vs RT-PCR vs RT-qPCR vs dPCR：差異比較

理解 PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR 與 dPCR 之間的細微差異，對於針對特定研究與診斷需求選擇合適的分子生物學技術至關重要。每種方法都有其獨特的優勢與應用。以下逐點說明：

起始材料（Starting Material）

• PCR 與 qPCR：使用 DNA 作為起始材料，適合用於特定 DNA 序列的擴增與定量。
  
• RT-PCR 與 RT-qPCR：以 RNA 為起始材料，需先透過反轉錄轉換為 cDNA，再進行分析，因此特別適合研究 RNA 病毒與基因表現。
  
• dPCR：具備彈性，可使用 DNA，或在反轉錄後使用 RNA。其特色是能進行 絕對定量，無論起始材料為何，都能提供無與倫比的精準度。
  

定量能力（Quantification）

• PCR（傳統 PCR）：僅能檢測 DNA 是否存在，無法進行定量。
  
• qPCR：在擴增過程中即時追蹤 DNA，能進行相對定量。
  
• RT-PCR：可檢測 RNA，但同樣無法量化。
  
• RT-qPCR：結合 RNA 分析與即時定量，可精準測量基因表現或病毒量。
  
• dPCR：提供 絕對定量，能直接計算核酸分子數目，無需標準曲線，精準度最高。

靈敏度（Sensitivity）

• PCR：靈敏度中等，足以應付許多研究需求，但對於稀有或低濃度目標效果有限。
  
• qPCR：靈敏度高，可即時偵測少量 DNA。
  
• RT-PCR：對 RNA 檢測有中等靈敏度，但定量精確度不足。
  
• RT-qPCR：結合高靈敏度與定量能力，適合分析低含量 RNA。
  
• dPCR：靈敏度最高，可偵測極低濃度目標與低頻突變，對需要極高精確度的應用不可或缺。

精確度（Precision）

精確度指的是 PCR 技術能否 持續提供準確且可重現的數據。對於需要細緻定量的實驗（如微小基因表現差異或低頻突變檢測），精確度至關重要。

• 傳統 PCR：適合核酸擴增，但在定量精確度上不足。
  
• qPCR：透過即時定量數據提升精確度，但結果仍可能依賴標準曲線。
  
• RT-PCR：重點在 RNA 偵測，屬於定性分析，對精確度要求不高。
  
• RT-qPCR：結合反轉錄與即時定量分析，能提升 RNA 定量的準確性。
  
• dPCR：精確度最高，透過將樣本分隔成數千反應單元，避免依賴標準曲線並降低變異，非常適合稀有突變檢測與絕對核酸定量。

操作難易度（Ease of Use）

操作便利性會影響技術在實驗室中的普及與效率，也涉及工作流程、訓練需求與應用可行性。

• 傳統 PCR：最簡單，僅需基本設備與操作流程，多數實驗室皆能使用。
  
• qPCR：需即時螢光監測，必須使用專用儀器並具備一定技術能力。
  
• RT-PCR：增加反轉錄步驟，操作比傳統 PCR 複雜。
  
• RT-qPCR：需同時進行反轉錄與即時監測，複雜度更高，需進階技術與設備。
  
• dPCR：最複雜，需要專門的分隔儀器與數據分析工具，雖然精準度無可比擬，但操作難度最大。

成本（Cost）

成本是選擇 PCR 技術的重要考量，尤其對於預算有限的實驗室。

• 傳統 PCR：最便宜，只需基本試劑與設備。
  
• qPCR：成本較高，需要螢光探針與即時檢測系統。
  
• RT-PCR：比傳統 PCR 更昂貴，需額外的反轉錄試劑。
  
• RT-qPCR：結合反轉錄與即時定量，成本更高。
  
• dPCR：最昂貴，需要高端分隔技術、專用儀器與耗材。

大量樣本處理（Large Volume Tested Samples）

在大量樣本分析中，PCR 技術需能處理足夠樣本量以避免稀有目標遺漏，否則定量會不準確。

• 傳統 PCR 與 RT-PCR：能處理中量樣本，但僅限定性分析。
  
• qPCR 與 RT-qPCR：適合較大量樣本，能在混合樣本中偵測低濃度核酸。
  
• dPCR：雖然精確度最高，但因分隔策略通常處理體積較小，不太適合大樣本量應用。
  

應用（Uses）

• 傳統 PCR：基因複製、突變檢測、基因分型。
  
• qPCR：基因表現定量、病原體檢測、基因變異分析。
  
• RT-PCR：RNA 研究，如 RNA 病毒檢測與基因表現分析。
  
• RT-qPCR：結合 RNA 偵測與精確定量，適合監測病毒載量與基因活性測量。
  
• dPCR：絕對精準的應用，如稀有突變檢測、複雜樣本分析、癌症液態活檢。

因素 Factor	PCR	qPCR	RT-PCR	RT-qPCR	dPCR
起始材料 Starting Material	DNA	DNA	RNA（轉換為 cDNA）	RNA（轉換為 cDNA）	DNA 或 RNA（經 cDNA）
定量能力 Quantification	否	是（即時，相對定量）	否	是（即時，相對定量）	是（絕對定量，精確計數）
靈敏度 Sensitivity	中等	高	中等	高	極高
精確度 Precision	可靠（判斷有無）	高（即時數據）	可靠（定性）	高（RNA 定量）	極高（稀有目標檢測）
操作難易度 Ease of Use	簡單	中等複雜度（需螢光探針）	需反轉錄步驟	較複雜（結合 RT 與即時定量）	複雜（需樣本分隔）
成本 Cost	低	中至高	中等	高	極高
樣本處理容量 Sample Volume Capacity	中等	大	中等	大	小
應用 Uses	基因複製、基因分型、突變檢測	基因表現分析、病原體檢測	RNA 病毒檢測、基因表現研究	病毒載量監測、RNA 定量	稀有突變檢測、絕對定量

其他 DNA 擴增技術

雖然 PCR 是 DNA 擴增的基石，但其他技術如 恆溫擴增（isothermal amplification）、全基因體擴增（whole genome amplification, WGA） 與 橋式擴增（bridge amplification） 也各自具備獨特優勢。以下將比較這些方法的優缺點，並與 PCR 進行對照。

恆溫擴增（Isothermal Amplification）

恆溫擴增是在 固定溫度下 進行 DNA 擴增，不同於 PCR 需要在不同溫度之間循環。

常見技術如 環介導等溫擴增（LAMP） 屬於此類。這些方法更快速且通常更便攜，因為不需要熱循環儀。例如 LAMP 可在一小時內完成 DNA 擴增，特別適合用於偏遠地區的疾病診斷等現場應用。

然而，恆溫擴增的特異性低於 PCR，可能導致假陽性。雖然等溫方法以速度與簡便見長，但 PCR 在精準度與擴增特定 DNA 序列的靈活性上仍更具優勢，特別是在需要詳細實驗室分析的場合。

全基因體擴增（Whole Genome Amplification, WGA）

WGA 的目的是 擴增整個基因體，而非僅限於特定 DNA 區段。

這項技術在處理非常微量或降解的 DNA 樣本時極為有用，例如古代文物或單一細胞的 DNA。雖然 WGA 能回收大量遺傳物質，但可能產生偏差，導致某些 DNA 區段被過度代表。

相比之下，PCR 聚焦於特定序列的擴增，具備高保真度，更適合精準的目標研究。WGA 適合需要廣泛基因資訊的應用，而 PCR 則在精確度與目標性研究上更具優勢。

橋式擴增（Bridge Amplification）

橋式擴增是一種應用於 次世代定序（NGS） 的方法。其過程是讓單股 DNA 與表面上的接頭序列（adapters）結合，形成「橋狀結構」，進而生成 DNA 聚落，產生數百萬份相同 DNA 拷貝以供定序使用。

這種方法對於定序流程極為高效，但不適用於其他 DNA 分析。相比之下，PCR 可靈活應用於各種場景（如診斷與基因複製），而橋式擴增僅限於 NGS。雖然橋式擴增確保了高通量定序，但 PCR 仍因其廣泛應用性與在多數分子生物學實驗室的普及性而居於核心地位。

PCR 的替代方案：Molsentech 的無擴增技術

PCR 與其進階變體雖然徹底革新了分子生物學，使核酸擴增與分析成為可能，但其流程往往複雜，需昂貴試劑與專用設備。儘管擴增功能強大，但也增加了診斷過程的複雜度與耗時。

Molsentech 正以其 Bio-FET 晶片技術 打破這些限制，實現 無需擴增的檢測。

作為台灣的前瞻生技新創，Molsentech 正以先進的 奈米技術、化學修飾、AI 演算法與自動化系統，打造超高靈敏、快速且精準的生物分子檢測平台，徹底重塑診斷領域。

在 新冠疫情 期間，Molsentech 的核酸檢測晶片獲得台灣 緊急使用授權（EUA），並於臨床實際應用中展現高度效能。除新冠之外，此平台更針對 阿茲海默症、癌症與傳染病 等重大疾病，實現更早期診斷與拯救生命的臨床應用。我們正以顛覆性的技術推動醫療革新、拯救生命。立即聯繫 Molsentech，了解我們的技術如何引領您進入未來診斷的全新境界。