奈米孔定序滿足了快速、可存取且經濟高效的基因組分析的需求。實現 DNA 和 RNA 的即時、可攜式定序徹底改變了生物學和環境科學的研究。在這裡，我們探討其核心原理、多樣化的應用、長讀長測序等關鍵優勢，以及進一步優化必須克服的挑戰。
什麼是奈米孔測序技術？
奈米孔測序是一種第四代測序方法，透過將 DNA 或 RNA 的單分子穿過稱為奈米孔的微小蛋白質通道，可以對它們進行直接測序。這種奈米孔通常由跨膜細胞蛋白組成，內徑約為1奈米。當 DNA 或 RNA 鏈穿過奈米孔時，它會暫時阻塞通道，導致離子電流發生獨特的變化。
這些變化對於每個核苷酸來說都是獨一無二的，使研究人員能夠準確確定序列並檢測分子內的化學修飾。該技術支援無標記定序，這意味著它不需要化學標記或 PCR 擴增，從而顯著簡化了定序過程。
奈米孔定序已經超越了奈米孔 DNA 定序和奈米孔 RNA 定序，最近的發展也指向奈米孔蛋白質定序的潛力和奈米孔基因定序中更廣泛的應用。
什麼是牛津納米孔和 ONT 定序？
牛津奈米孔技術公司（ONT）是牛津大學的衍生公司，在奈米孔定序技術的發展和商業化中發揮了關鍵作用。
ONT 推出了突破性的定序設備，從便攜式手持式定序儀（如 MinION）（非常適合即時現場分析）到桌面和高通量定序平台（分別是 GridION 和 PromethION）。ONT 不斷創新，正在進行的研究旨在提高定序的準確性、速度和便攜性，使基因組定序更容易獲得並在臨床診斷、環境監測和個人化醫療等領域廣泛使用。
納米孔有什麼用？
奈米孔透過實現即時單分子檢測，正在改變科學家分析分子的方式。讓我們看看它的一些應用：
直接 DNA 和 RNA 定序
奈米孔允許對 DNA 和 RNA 進行測序，無需 PCR 擴增或化學標記，從而促進更簡單的基因組研究。這消除了 PCR 偏差，保留了鹼基修飾，並提供了對表觀遺傳變化和 RNA 轉錄變異的更準確的見解。它對於分析複雜的基因組區域、轉錄組學分析和識別 RNA 測序中的剪接變異特別有價值。
基因分型
奈米孔定序提供了一種相對便宜的基因分型方法，使基因分析可用於更廣泛的應用。其經濟性和速度使其對群體基因組學、進化生物學和個人化醫療特別有益。
質粒和電阻組的表徵
該技術可有效表徵廢水處理廠細菌中碳青霉烯酶編碼的質粒，從而能夠詳細分析抗生素抗藥性基因及其在環境環境中的潛在傳播。奈米孔定序可幫助研究人員關聯抗藥體表型和基因型，這對於管理公共衛生中的抗生素耐藥性至關重要。
表觀遺傳修飾的檢測
奈米孔定序可以檢測重要的表觀遺傳修飾，例如 5-甲基胞嘧啶 （5mC）、5-羥甲基胞嘧啶 （5hmC），甚至 DNA 損傷位點，如鹼性位點。最新的奈米孔模型還可以檢測 N6-甲基腺嘌呤 （6mA） 等修飾，顯著增強表觀遺傳學、發育生物學和癌症診斷方面的研究能力。
奈米孔定序技術的好處
與傳統定序方法相比，奈米孔定序技術具有幾個顯著的優勢，使其成為一種有價值的工具。
長讀長測序
奈米孔測序能夠讀取超長的 DNA 片段，單次讀取範圍從數千到數百萬個核苷酸。這種超長讀取能力（10⁴–10⁶鹼基）使研究人員能夠分析複雜的基因組區域，例如重複序列、高GC含量區域、端粒和結構變異。透過提供對基因組、轉錄組和表觀基因組的更全面的了解，它在解析大規模基因組組裝和研究非編碼 DNA 區域方面特別有用。
即時結果
奈米孔定序可以對基因組數據進行即時分析。測序過程可以達到每秒數百千鹼基的速度，每條DNA鏈以每秒約250至450個鹼基的速度通過奈米孔。這種快速處理可以立即解釋數據，對於疫情監測、傳染病追蹤和臨床診斷等時間敏感的應用來說非常有價值。
機動性
奈米孔定序最顯著的優點之一是其便攜性。MinION 等設備結構緊湊、重量輕，具有高度移動性，適合即時應用、現場研究和環境測試。這種移動性對於追蹤疾病爆發和在偏遠地區進行即時基因組監測特別有利。
成本效益
與傳統定序平台相比，奈米孔定序相對具有成本效益。它提供低成本的基因分型，並有可能實現經濟實惠的測序，一些系統以每千兆基序列約 25 至 40 美元 的價格提供測序。此外，奈米孔技術需要最少的樣品製備，從而降低試劑成本，並使更廣泛的研究人員和機構更容易進行測序。
奈米孔定序技術的挑戰
儘管具有優勢，奈米孔技術仍然面臨阻礙其廣泛採用的重大挑戰，包括準確性問題、高錯誤率等。以下是仍需要解決的主要問題。
與其他方法相比，錯誤率更高
一項重大挑戰是該技術固有的錯誤率，與其他定序方法相比，該錯誤率歷來更高。早期的奈米孔測序工作在實現單核苷酸解析度方面面臨困難，因為DNA鏈通過奈米孔的易位速度很快，導致記錄挑戰和背景噪音。儘管在提高準確性方面取得了進步，但實現始終如一的低錯誤率仍然是一項持續的努力。
不穩定的 DNA 傳代
控制 DNA 分子通過奈米孔的速度對於準確定序至關重要。核苷酸的快速移動（以微秒為單位）給記錄精確測量結果帶來了挑戰。蛋白質工程和分子馬達的開發等策略已被採用來調節這種易位速度，但實現最佳控制仍然是一個技術障礙。
孔徑尺寸不一致
保持奈米孔精確定義和均勻的尺寸是一項重大挑戰。為了提高測序的準確性和分辨率，橫向和垂直尺寸（分別為孔徑和長度）都應盡可能小。孔徑的變化會影響電訊號檢測的一致性，從而可能降低測序精度。
從奈米孔到生物 FET：利用 Molsentech 釋放生物傳感的新可能性
奈米孔定序為基因組學的變革性進步鋪平了道路，提供了前所未有的便攜性、即時數據採集和長讀長定序功能。儘管奈米孔定序具有變革性影響，但仍面臨一些挑戰。保持一致的孔徑、優化訊號準確性和提高測序錯誤率等問題繼續阻礙廣泛採用。
認識到這些局限性， Molsentech 等公司探索了替代生物傳感方法，重點關注基於奈米線的場效應電晶體 （FET） 生物感測器，突破了即時分子檢測的界限。
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